脊肌萎缩症的基因诊断


我们已经说过,脊肌萎缩症是典型的常染色体隐性遗传病,其致病基因是SMN1基因。每个人都有两个SMN1基因,只有两个SMN1基因都发生致病突变才会导致脊肌萎缩症的发生。目前已知SMN1基因的致病突变有两种不同的形式。约95%脊肌萎缩症患者的SMN1基因突变属于“纯合缺失”类型。所谓纯合缺失,是指两个SMN1基因都缺失了,这样身体里就没有SMN1基因,所以会患上脊肌萎缩症。这是SMN1基因突变的常见形式。

另5%左右患者的基因突变不是纯合缺失,而是只缺了一个基因,这种缺失我们叫做“杂合缺失”。按理来讲,杂合缺失的人体内还有一个SMN1基因,他是不会发病的,应该成为无表现的携带者。但是,这些患者体内的那个SMN1不是功能正常的SMN1基因。他们的SMN1基因发生了点突变或者其他形式的突变,使得这个SMN1基因没有功能。这样,尽管他们只缺失了一个SMN1基因,却因为另一个SMN1基因没有功能同样会成为脊肌萎缩症患者。

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上图为你演示了两种不同的SMN1基因突变。正常人拥有两个正常的SMN1等位基因(红色)。如果缺失一个基因(白色)则为常见的携带者,如果两个等位基因都缺失则成为纯合缺失型患者。如果正常人的一个SMN1基因发生突变(下左图),那么他就是少见的携带者类型。如果缺失一个SMN1基因,又带了一个突变的SMN1基因,就会成为脊肌萎缩症患者。

打个比方,某个保险柜的门上设置了两把锁。如果两把锁都没了,那么保险柜显然也就没有了保险的功能,这就是我们所说的纯合缺失型脊肌萎缩症。如果一把锁没了,而另一把锁换了,保险柜依然没有保险的功能,这就是我们说的突变型脊肌萎缩症。目前,纯合缺失型和突变型脊肌萎缩症在基因层面都可以获得诊断,只是方法的复杂性有所不同。

脊肌萎缩症的基因诊断流程

当医生临床脊肌萎缩症就应该首选SMN1基因纯合缺失检测作为进一步诊断方法。由于SMN1基因检测只需要抽一次血,而且已经成为脊肌萎缩症诊断的标准方法,而肌电图检测患儿较为痛苦同时参考价值相对有限,因此我建议临床疑诊脊肌萎缩症的患者不需要做肌电图检测,而应直接进行基因检测。

SMN1基因纯合缺失检测一般针对SMN1基因的7号外显子进行,以7号外显子是否存在缺失来判断SMN1基因是否缺失,因为7号外显子是SMN1基因的关键区域。纯合缺失检测方法常用的有PCR/RFLP法和荧光定量PCR等。
•PCR/RFLP:PCR/RFLP是经典的SMN1基因7号外显子纯合缺失诊断方法。Dde I与Hinf I是常用的两种内切酶。从方法学上来看,Dde I可能会因为酶切不干净而产生假阴性,Hinf I相对更可靠一些。PCR/RFLP的缺点是无法判断携带者。
•qPCR:荧光定量PCR能够准确分辨患者、携带者和正常人,并且操作简单,是一种拥有更大灵活性的检测方法。
•MLPA:MLPA是一种中通量的检测方法。它的好处是可以通过一个反应检测7号、8号外显子的拷贝数并且检测几个常见点突变位点。MLPA的主要问题是对实验室的质控管理要求较高,它的检测灵活性不及定量PCR。

如果检出SMN1基因7号外显子纯合缺失,可以确诊为脊肌萎缩症,分型需要依赖临床表现和疾病发展进行判断。如果检出患者存在2拷贝SMN1基因(定量PCR法),可基本排除脊肌萎缩症的诊断。

如果患者临床疑诊为脊肌萎缩症,而SMN1基因检测发现患者为杂合缺失,这时候首先建议对患者再次进行临床评估。如果临床症状符合脊肌萎缩症,肌电图等检查也支持诊断,则需要进行SMN1基因外显子测序。由于基因序列的特殊性,SMN1基因测序存在一定的技术难度。常用的方法有以下几种:
•DNA水平普通测序:因为无法排除SMN2基因的干扰,因此DNA水平的外显子测序只能作为筛查方法进行使用。对于DNA水平测序发现突变的患者要做进一步检测确认。
•长程PCR测序:通过特殊的引物设计将一整段SMN1基因序列扩增出来以去除SMN2基因的影响。长程PCR的问题是扩增片段长,实验不好设计。
•RNA水平测序:通过获得患者RNA进行RT-PCR然后挑单克隆测序是最准确的点突变检测方法。它的缺点是需要用新鲜血液即使抽提RNA,实验比较耗费时间,同时成本较高。

不同的实验室会根据自身实际条件选择适合自己的方法。对于患者和家属来说,你只需要记住这一流程:医生临床诊断脊肌萎缩症,进行SMN1基因纯合缺失检测。如为纯合缺失,则确诊;如为杂合缺失,则再次由医生进行临床评估,并进行SMN1基因点突变检测。并非每一名脊肌萎缩症患者都可以找到基因突变,但是通过这两个步骤,SMN1基因突变的检出率在98%以上。

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